Eine Ballaststoffergänzung schützt vor Antibiotika

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5161 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Antibiotika-induzierte Darmdysbiose (AID) ist eine häufige und schwerwiegende Nebenwirkung des Antibiotikaeinsatzes und die Linderung dieser Dysbiose ist ein entscheidendes therapeutisches Ziel. Wir schlagen vor, dass die Ernährung des Wirts die chemische Umgebung des Darms modulieren kann, was zu Veränderungen der Struktur und Funktion des Mikrobioms während der Antibiotikabehandlung führt. Eine Darmdysbiose ist typischerweise durch einen Anstieg des aeroben Stoffwechsels der Atemwegsbakterien, des Redoxpotentials und der Häufigkeit von Proteobakterien gekennzeichnet. In dieser Studie untersuchen wir Nahrungsergänzungsmittel mit Ballaststoffen als potenzielle Modulatoren der chemischen Umgebung im Darm, um dieses Muster der Dysbiose zu reduzieren. Unter Verwendung definierter Diäten und der Sequenzierung des gesamten Genoms weiblicher muriner Mikrobiome während der Diätmodulation und der Antibiotikabehandlung stellen wir fest, dass Ballaststoffpräbiotika die Auswirkungen der Antibiotikabehandlung auf die Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms deutlich reduziert haben. Wir beobachten eine verringerte Häufigkeit aerober Bakterien sowie Stoffwechselwege, die mit dem oxidativen Stoffwechsel verbunden sind. Diese metatranskriptomischen Ergebnisse werden durch chemische Messungen von eH und pH bestätigt, was darauf hindeutet, dass Ballaststoffe die dysbiotischen Wirkungen von Antibiotika dämpfen. Diese Arbeit weist darauf hin, dass Ballaststoffe als potenzielles Therapeutikum für AID wirken können, indem sie den bakteriellen Stoffwechsel im Darm modulieren, um einen Anstieg des Redoxpotentials zu verhindern und Kommensalmikroben während der Antibiotikabehandlung zu schützen.

Antibiotika sind ein wesentlicher Bestandteil der modernen Medizin und dienen der Abwehr von Infektionen. Ihr Einsatz führt jedoch oft zu Kollateralschäden am Darmmikrobiom1,2,3. Diese AID kann zu gesundheitlichen Komplikationen wie entzündlichen Darmerkrankungen, gestörter Immunfunktion, Infektionen und Stoffwechselstörungen führen4. In mehreren Studien wurden Methoden zur Verringerung des antibiotischen Stresses auf das Mikrobiom mithilfe oraler Arzneimitteladsorbentien und probiotischer Nahrungsergänzungsmittel untersucht5,6.

Diese Ansätze können jedoch die Wirksamkeit des Arzneimittels verringern oder im Falle von Probiotika das Darmungleichgewicht verstärken6. In dieser Arbeit nutzen wir die Ernährung, um das chemische Milieu im Darm zu verändern und untersuchen, wie Ballaststoffpräbiotika AID lindern können, indem sie den Anstieg des Redoxpotentials im Darm verhindern, der nach einer Antibiotikabehandlung beobachtet wird4,7,8.

Die Art der Kohlenstoffquelle in der Nahrung kann bestimmen, welche Elektronenakzeptoren die Bakterien im Darm erreichen und spezifische und vorhersehbare biochemische Reaktionen auslösen9,10,11. Beispielsweise werden einfache Kohlenstoffquellen, die in der westlichen zuckerreichen Ernährung vorkommen, schnell vom Wirt absorbiert, wodurch der Kohlenstoff für Mikroben im Darm begrenzt wird. Da diese Mikroben um den begrenzten verfügbaren Kohlenstoff konkurrieren, verstoffwechseln sie vom Wirt stammenden Kohlenstoff aus den Schleimhäuten im Darm12,13. Dies führt zu einer verstärkten Darmentzündung und verändert die Struktur des Mikrobioms, indem Bakterien selektiert werden, die in dieser entzündlichen und aeroben Umgebung gedeihen14. Diese dysbiotische Umgebung kann Elektronenakzeptoren wie O2, NO3, Fe3+ bereitstellen und thermodynamisch für Stoffwechselreaktionen mit höherer Redoxpotentialenergie selektieren11,15. Andererseits selektieren Ballaststoffe Mikroben, die mithilfe des fermentativen Stoffwechsels komplexe Polysaccharide verstoffwechseln können. Kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), die von Bakterien durch Fermentation produziert werden, werden von Kolonozyten in einer sauerstoffverbrauchenden Reaktion verstoffwechselt16,17,18. Aufgrund dieser anaeroben Umgebung werden Stoffwechselreaktionen mit geringerer Redoxpotentialenergie, wie beispielsweise die Fermentation, thermodynamisch begünstigt.

Eine aktuelle Sichtweise über die Anfälligkeit von Bakterien gegenüber Antibiotika legt nahe, dass eine Änderung des Stoffwechsels vor Antibiotika-Stress schützen könnte. Mehrere In-vitro-Studien haben diese Hypothese überprüft und festgestellt, dass die Unterdrückung des mikrobiellen Stoffwechsels die Anfälligkeit für Antibiotika verringert19,20,21,22. Diese Studien legen nahe, dass die Anfälligkeit mit Signaturen der Stoffwechselaktivität wie einer Hochregulierung des vergeblichen Zyklus, einem ATP-Umsatz, einem höheren Membranpotential und einer erhöhten Anzahl radikalischer Spezies zusammenhängt. Umgekehrt hat sich gezeigt, dass ein erhöhter pH-Wert, eine Entkopplung des Elektronentransports und eine verringerte Glukoseverfügbarkeit den mikrobiellen Stoffwechsel unterdrücken und vor Antibiotika schützen20,22. Dieser stoffwechselgesteuerte Mechanismus der Anfälligkeit wurde größtenteils in vitro untersucht. Neuere Arbeiten deuten jedoch auch darauf hin, dass die Modulation des Stoffwechsels von Darmbakterien im Wirt auch Auswirkungen auf AID haben könnte.

Mehrere neuere Studien haben damit begonnen, die Rolle der Wirtsernährung bei AID zu untersuchen. Ballaststoffe aus der Nahrung wie Xanthangummi23 schützen nachweislich vor dem Rückgang der Bakterienvielfalt, der nach einer Antibiotikabehandlung auftritt. Studien haben begonnen zu zeigen, dass eine fett- und zuckerreiche westliche Ernährung AID verschlimmern kann2,3,24 und eine In-vitro-Supplementierung mit präbiotischen Ballaststoffen kann Darmkommentare vor Antibiotika schützen. Diese Zusammenhänge sind vielversprechend, es bestehen jedoch erhebliche Wissenslücken hinsichtlich der Mechanismen hinter den Wechselwirkungen zwischen Ernährung und Antibiotika in vivo. In dieser Studie nutzen wir die metagenomische und metatranskriptomische Sequenzierung des Darmmikrobioms, um hochauflösende Daten über die Zusammensetzung und Funktion der Bakterien zu erfassen. Wir kombinieren diese Sequenzierungsdaten mit chemischen Messungen, um Kontext für angereicherte Stoffwechselwege bereitzustellen. Wir fanden heraus, dass eine Ballaststoffergänzung die AID reduzierte, wenn sie vor, während oder nach einer Antibiotikabehandlung über einen redoxgesteuerten Mechanismus verabreicht wurde.

Wir verwendeten weibliche C57BL/6-Mäuse, um die Auswirkungen der Ergänzung mit gereinigten Pflanzenfasern auf AID bei Mäusen zu testen, denen die Diät mit gereinigtem AIN-93G (Envigo-Teklad) verabreicht wurde. Diese Diät besteht zu 80 % aus einer Zusammensetzung, die eine 20 %ige Ergänzung einer Kohlenstoffquelle ermöglicht. Wir verwendeten Glukose als unseren ballaststoffarmen, nicht ergänzten Zustand und einen Cocktail aus 7 Pflanzenfasern, darunter (Zellulose, Levan, Dextrin, Pektin, Inulin, Beta-Glucan, Arabinoxylan) (Abb. 1a) für den ballaststoffergänzten Zustand. Als ballaststofffreie Ergänzung wurde Glukose gewählt, um das Kohlenhydrat-Fett-Protein-Verhältnis aufrechtzuerhalten und die Zugänglichkeit der Mikrobiota zu verringern. Ballaststofffreie Diäten enthalten typischerweise einfache Zucker anstelle komplexer Polysaccharide, wie in Desai et al.25 und Kamada et al.26 gezeigt. Einfachzucker werden verwendet, weil sie für den Wirt sehr gut zugänglich sind und wahrscheinlich im Dünndarm verarbeitet werden, wodurch der Zugang zur Mikrobiota eingeschränkt wird10. Darüber hinaus ist Glukose ein häufiger Nahrungsbestandteil, der möglicherweise weniger schädliche Auswirkungen auf den Wirt hat als andere Monosaccharide27, wie z. B. Fruktose, die nachweislich kurzfristig nierentoxisch ist27.

Modifizierte Versionen der gereinigten Nagetiernahrung AIN-93G, ergänzt mit gereinigten Fasern, wurden verwendet, um die Kohlenstoffquelle für das Darmmikrobiom zu modulieren. Die 0-Fasergruppe erhielt keinen Ballaststoffzusatz und der Nahrung wurde 100 % Glukose in einem Verhältnis von 20 % zugesetzt. Die mit Ballaststoffen ergänzten Mäuse erhielten einen Cocktail aus 7 gereinigten Pflanzenfasern in den dargestellten Verhältnissen. (a) Mäusediät und (b) Antibiotika-Interventionsschema. Die mittlere Shannon-Diversität (n = 12 für Tag 0,7) (n = 6 für die verbleibenden Zeitpunkte) für Stufe 1 (rosa), Stufe 2 (grün) und Stufe 3 (lila) wird mit SEM-Intervallen in der Kontrolle angezeigt (ca ). Farbige Sterne entsprechen der Größe des p-Werts gemäß dem Two-Way Mixed model ANOVA & Dunnett. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. p-Werte am Tag 11: rosa – 0,0014, grün – 0,0118. p-Werte am Tag 12: rosa – 0,0002, grün – 0,0004, lila 0,0309. p-Werte am Tag 16: rosa – 0,0003, grün – 0,0006, lila 0,0003. p-Werte am Tag 22: rosa – 0,0001, grün – <0,0001, lila 0,0207. Mit Antibiotika behandelte Mäuse, dargestellt in (d). p-Werte am 8. Tag: rosa – 0,0452. p-Werte am Tag 11: rosa – 0,0363, grün – 0,0060. p-Werte am Tag 12: grün 0,0428. p-Werte am Tag 22: grün 0,0001. Jede Phase wird mit einer ballaststofffreien, nicht ergänzten Ernährung verglichen. Die mit PERMANOVA berechnete antibiotische Wirkungsgröße in allen Supplementierungsstadien wurde anhand von Bray-Curtis-Distanzwerten und der PCoA-Methode berechnet. Die Farbintensität stellt den p-Wert dar (Skala angezeigt). Die vollständigen Ergebnisse werden in den Quelldaten (e) angezeigt. Relative Häufigkeit von Bakterienfamilien im Verlauf des Experiments (f).

Wir verwendeten eine longitudinale 16S-rRNA-Sequenzierung von Kot, um das optimale Stadium der Ballaststoffergänzung bei der Erholung nach Amoxicillin (150 mg/kg ad libitum in Wasser) zu bestimmen (Abb. 1b). Zwischen den Gruppen wurden nicht signifikante Gewichtsunterschiede beobachtet (ergänzende Abbildung 1a). Es wurde beobachtet, dass Glukose in Abwesenheit von Antibiotika die mikrobielle Diversität während des gesamten Experiments verringerte (Abb. 1c). Die Ballaststoffergänzung vor der Behandlung mit Antibiotika (AB) ([S1]: Vorher) hatte eine signifikant geringere (p < 0,05) anfängliche Verringerung der Diversität und eine vollständigere Erholung im Vergleich zur Glukosegruppe (Abb. 1d). In ähnlicher Weise sorgte auch die Ballaststoffergänzung während der Antibiotikabehandlung ([S2]:Während) für einen signifikanten Schutz sowohl in der Behandlungsphase (p < 0,01) als auch in der Genesungsphase (p < 0,001). Schließlich führte die Ballaststoffergänzung nach der Antibiotikabehandlung ([S3]:Nachher) zu einer verbesserten Erholung mit einer Zunahme der mikrobiellen Vielfalt im Vergleich zur Glukosegruppe (Abb. 1d). Die Wirkungsgröße von Antibiotika war während der Behandlung mit Ballaststoffergänzung deutlich geringer (Abb. 1e) [S1]:Vorher und [S2]:Während. Die Ergänzung mit Ballaststoffen nach der Behandlung reduzierte die antibiotische Wirkung nur während der Genesung (Abb. 1e). Dementsprechend stellten wir fest, dass die Nahrungsergänzung mit Ballaststoffen in verschiedenen Stadien zu erheblichen Veränderungen der mikrobiellen Zusammensetzung während der Behandlung führte. Taxonomische Merkmale deuteten auch auf eine geringere Störung des Mikrobioms unter Ballaststoffergänzung hin (Abb. 1f). Zusätzlich zu den oben genannten Daten stellten wir fest, dass die Ergänzung einfach gereinigter Fasern mit einer Zusammensetzung von 5 % (ergänzende Abbildung 1b) sich auch positiv auf die Wiederherstellung des Mikrobioms nach der Antibiotikabehandlung auswirkte (ergänzende Abbildung 1c – f). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine geringfügige Änderung der Ernährung die Erholung des Mikrobioms nach einer Antibiotikabehandlung beeinflussen kann. Aus translatorischer Sicht ist es besonders vorteilhaft, dass die Nahrungsergänzung zum Zeitpunkt der Antibiotikagabe genauso wirksam ist wie vor der Behandlung.

Um die taxonomische und funktionelle Auflösung zu erweitern28,29 verwendeten wir eine metagenomische und metatranskriptomische Sequenzierung des Blinddarminhalts von Mäusen am Tag 1 und am Tag 5 nach der Antibiotikabehandlung eines Wiederholungsexperiments in der Gruppe [S2]:During (n = 6) (Abb. 2a). Mäuse zeigten am 5. Tag nach der Antibiotikabehandlung keine signifikanten Veränderungen der Darmhistopathologie (ergänzende Abbildung 2a, ergänzende Daten 1) oder der Bakterienlast am 5. Tag (ergänzende Abbildung 2b). Hier stellten wir auch fest, dass bei Mäusen, die sich mit Glukose ernährten, die Alpha-Diversität nach Antibiotikagabe zu beiden Zeitpunkten deutlich stärker abnahm (Abb. 2b). Darüber hinaus war die Größe des Antibiotika-Effekts auf die Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms aus metagenomischen bzw. metatranskriptomischen Daten bei mit Glukose ergänzten Mäusen stärker verschoben als am Tag 1 und Tag 5 mit Ballaststoffen nach der Antibiotikabehandlung (Abb. 2c, ergänzende Abb. 2d – g). . Die Glukose-Supplementierung war mit einem stärkeren Anstieg der Bakterienarten im Proteobacteria-Stamm (rot) in den metagenomischen und metatranskriptomischen Daten am Tag 1 und Tag 5 nach der Antibiotikabehandlung verbunden (Abb. 2d – g) (Ergänzungsdaten 4). Am fünften Tag des Experiments beobachteten wir, dass Glukose große Veränderungen in der Artenzusammensetzung und -funktion aufwies, hauptsächlich bei Proteobakterienarten (Abb. 2e, g). In den kurz gelesenen metagenomischen Daten waren Proteobacteria und Verrucomicrobia phyla bei den mit Glukose ergänzten Mäusen erhöht (Abb. 2k, I) (Ergänzungsdaten 3), während die Ballaststoffergänzung zu einem Anstieg von Archaea und Actinobacteria führte (Abb. 2m, l). Der Zusammenhang mit Proteobakterien und Dysbiose14 lässt darauf schließen, dass die Wirkung von Antibiotika durch Glukose verstärkt und durch Ballaststoffe begrenzt wird. Archaealarten reagieren empfindlich auf aerobe Umgebungen30 und ihre Zunahme der Häufigkeit durch Ballaststoffergänzung deutet darauf hin, dass Ballaststoffe zur Aufrechterhaltung der gastrointestinalen (GI) Anaerobität beitragen. Wir beobachteten ähnliche Muster taxonomischer Veränderungen mithilfe der De-novo-Genassemblierung kurz gelesener metagenomischer Daten. Wir haben 54 hochwertige metagenomassemblierte Genome (MAGs) aus unseren Proben zusammengestellt (ergänzende Abbildung 3a, b). Mithilfe einer linearen Diskriminanzanalyse der relativen Häufigkeit von MAGs identifizierten wir signifikante Veränderungen in der Mikrobiomzusammensetzung im Zusammenhang mit der Glukose- und Ballaststoffergänzung während der Antibiotikabehandlung 5 Tage nach der Antibiotikaverabreichung (ergänzende Abbildung 3g). Diese Verschiebungen stimmen mit der Short-Read-Analyse überein (ergänzende Abbildung 3c – f) und legen nahe, dass es starke Unterschiede in der Zusammensetzung zwischen Glukose- und Ballaststoffergänzung während der Antibiotikabehandlung gibt.

ein schematisches Mausexperiment (n = 6). b Antibiotika-induzierter Rückgang der Diversität D1 und D5 während des Experiments an mit Glukose und Ballaststoffen ergänzten Mäusen (n = 6). Kruskal Wallis mit Dunns Korrektur. Tag 1 Glukose-Adj.-p-Wert = 0,0031. Tag 5 Glukose-Adj.-p-Wert = 0,0049. c Die Größe der antibiotischen Wirkung wurde aus PERMANOVA-Analysen der Bray-Curtis-Abstände unter Verwendung der PCoA-Methode aus metagenomischen und metatranskriptomischen Datensätzen berechnet (n = 6). Das Diagramm zeigt die Effektgröße (Größe des Punkts) mit der Signifikanz der Adj-p-Werte an, die durch Signifikanzsterne gekennzeichnet sind. Vollständige Ergebnisse werden in den Quelldaten angezeigt. DESeq2 signifikanter Arten, die mit jeder Gruppe an Tag 1 und Tag 5 des Experiments assoziiert sind, aus metagenomischen (d, f) und metatranskriptomischen (e, g) Daten der antibiotischen Wirkung auf Glukose gegenüber Ballaststoffen. Proteobakterienarten sind rot. log2 FC > 1 und p-adj <0,05 (n = 6). Die vollständigen Ergebnisse sind in den Zusatzinformationen verfügbar und in Rshiny (https://belenkylab.shinyapps.io/shiny) visualisiert. h Veränderungen im Bacteroides-Stamm an Tag 1 und Tag 5 des Experiments, adj. p-Wert = 0,0049. i Verrucomicrobia phylum, adj p-Wert = 0,0004. j Firmicutes phylum k Proteobacteria phylum, Glukose Tag 5 vs. Faser Tag 5 adj p-Wert = 0,0014, Faser Tag 1 vs. Faser Tag 5 adj p-Wert = 0,0478. l Actinobacteria phylum, adj p-Wert = 0,0330. m Archaea, adj p-Wert = 0,0002. Für h–m (n = 6) Mittelwert ± SEM Kruskal Wallis mit Dunn-Korrektur *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Frühere In-vitro- und In-vivo-Studien haben gezeigt, dass eine Veränderung im bakteriellen Stoffwechsel die Toleranz oder Anfälligkeit gegenüber Antibiotika fördern kann. Im Allgemeinen ist ein aktiver Stoffwechsel mit einer erhöhten Anfälligkeit verbunden, während eine Stoffwechselruhe Schutz bietet1,19,21. Um Veränderungen der Stoffwechselfunktion im Darmmikrobiom zu bestimmen, verwendeten wir die metatranskriptomische Sequenzierung von Blinddarmproben von Mäusen. Wir beobachteten einzigartige Stoffwechselsignaturen im Darmmikrobiom von Mäusen, denen Glukose und Ballaststoffe verabreicht wurden. Unter Verwendung der SEED-Subsystemdatenbank fanden wir einen signifikanten Anstieg der Signalwege, die am Atemstoffwechsel bei Mäusen mit Glukosezusatz während der Antibiotikabehandlung beteiligt sind (p < 0,05) (Abb. 3a, b). Umgekehrt war die Nahrungsergänzung mit Ballaststoffen mit erhöhten Stoffwechselwegen verbunden, die der Ruhephase, der Kohlenstofffixierung und dem Fettsäurestoffwechsel zugeordnet sind. Dies weist darauf hin, dass Glukose und Ballaststoffe unterschiedliche Auswirkungen auf die Bioenergetik von Darmbakterien haben, und dies könnte zu den beobachteten Unterschieden in der taxonomischen Reaktion beitragen. Mithilfe der HUMAnN3.0-Datenbank konnten wir einen signifikanten Anstieg der Wege für die Peptidoglycan-Biosynthese am ersten Tag nach der Antibiotikabehandlung feststellen (Abb. 3d). Diese Daten deuten darauf hin, dass mit Glukose ergänzte Darmbakterien in einen vergeblichen Kreislauf der Peptidoglycan-Biosynthese mit einem überaktiven Stoffwechsel eintreten. In vitro wurde ein Peptidoglycan-Kreislauf beobachtet, aber hier zeigen wir, dass komplexe mikrobielle Gemeinschaften in vivo dem gleichen Phänomen folgen19. Am fünften Tag des Experiments führte die Glukose-Supplementierung zu einer erhöhten Expression von Fettsäure-Biosynthesewegen sowie der Häm-Biosynthese (Abb. 3e). Die Ballaststoffergänzung führte zu einem Anstieg der Ubiquinol-Biosynthese (Abb. 3d) sowie zu einem Anstieg der als Calvin-Benson-Bassham bezeichneten Kohlenstofffixierungswege (Abb. 3d), trotz fehlender Photosynthesemaschinerie in MAGs (gescreente Proteinsequenzen in Supplementary Data 2). ). Der Ribulosemonophosphat-Zyklus (RuMP) ist ein weiterer Weg zur erhöhten Kohlenstofffixierung, der wahrscheinlich aus der archaischen Methanogenese resultiert, die typischerweise der Faserfermentation nachgeschaltet ist30 (Abb. 3e). Sowohl die Ubiquinol- als auch die Häm-Biosynthese bauen Eisen-Schwefel-Cluster-Proteine ​​für biochemische Reaktionen auf. Eine Zunahme der Häm-Biosynthese deutet jedoch darauf hin, dass die chemische Umgebung energiereichere Elektronentransfers enthält31, möglicherweise aufgrund des erhöhten aeroben Stoffwechsels. Dies ergänzt die Daten, die zeigen, dass eine Glukoseergänzung ein aerobes, entzündliches gastrointestinales Milieu fördert.

DESeq2-Analyse des metatranskriptomischen Datensatzes, abgestimmt auf die SEED-Datenbank (n = 6). Signifikanter Anstieg der Glukose- (orange) und Ballaststoffzufuhr (blau) D1 (a) und D5 (b) während der Antibiotikabehandlung. Log2 FC ± SEM padj < 0,05 und log2 FC > 2. Es wird eine antibiotische Wirkung auf Glukose gegenüber Ballaststoffen gezeigt. Vollständige Ergebnisse in den Zusatzinformationen. c Schematische Darstellung von Proteinen, die am bakteriellen Elektronentransport beteiligt sind. Signifikante Signalwege erhöhten sich bei Ballaststoffen (links) und Glukose (rechts), wie durch HUMAnN3.0 und MaAsLin2 bestimmt. Tag 1 (n = 6) (d) und Tag 5 (n = 6) (e) qval = FDR, Koeffizient auf der x-Achse dargestellt. Die vollständigen Ergebnisse finden Sie in den Zusatzinformationen. Signifikante Veränderungen in der Expression von Elektronentransportproteinen (Komplex 1, Flavoproteine, Cytochrome), abgestimmt auf die Refseq-Datenbank D1 (n = 6) (f) und D5 (n = 6) (g) während der Antibiotikabehandlung. padj < 0,0001 und log2 FC > 2. Log2 FC ± SEM. Es wird eine antibiotische Wirkung auf Glukose im Vergleich zu Ballaststoffen gezeigt. Vollständige Ergebnisse in den Zusatzinformationen.

Um diesen Anstieg des Atmungsstoffwechsels besser zu verstehen, haben wir die Genexpression von Proteinen quantifiziert, die an der Elektronentransportkette (ETC) beteiligt sind (Abb. 3c). Mithilfe einer Differentialhäufigkeitsanalyse transkriptomischer Lesevorgänge, die an der RefSeq-Datenbank (Supplementary Data 6) ausgerichtet sind, stellten wir fest, dass Glukose signifikant mit einer erhöhten ETC-Aktivität während der Antibiotika-Exposition assoziiert war.

Die Expression von Komplex 1, Flavoproteinen und Cytochromen war bei mit Glukose ergänzten Mäusen nach der Antibiotikabehandlung höher (p < 0,0001) (Abb. 3f, g). Diese Eisen-Schwefel-Clusterproteine ​​sind entscheidend für die energieumwandelnden Elektronentransferreaktionen, die Bakterien zur Energiegewinnung nutzen15. Der allgemeine Rückgang dieser Transkripte in der Ballaststoffdiät lässt darauf schließen, dass diese Gemeinschaft über einen geringeren Atemstoffwechsel verfügt. Als interne Kontrolle verwendeten wir die Beta-RNA-Polymerase-Untereinheit als Haushaltsgen und stellten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen fest (Ergänzungsdaten 5).

Wir quantifizierten die Expression des Antibiotikaresistenzgens (ARG) in unseren Behandlungsgruppen und stellten fest, dass die Ballaststoffdiät im Vergleich zu Glukose eine stärkere ARG-Expression bei Proteobakterienarten aufwies (ergänzende Abbildung 4). Trotz dieses ARG-Expressionsmusters nimmt die Proteobakterienhäufigkeit jedoch am fünften Tag des Experiments ab, was die Rolle des bakteriellen Stoffwechsels in den beobachteten Phänotypen verstärkt.

Um den Mechanismus hinter dieser Stoffwechselverschiebung als Reaktion auf die getesteten Diäten besser aufzuklären, haben wir HUMAnN3.0 und MaAsLin2 verwendet, um Veränderungen in biochemischen Prozessen auf der bioenergetischen Skala zu identifizieren, die mit Diäten unter Antibiotikabehandlung verbunden sind. Die Entflechtung von Stoffwechsel und Bioenergetik im Darmmikrobiom ist aufgrund des begrenzten Verständnisses der bakteriellen Biochemie der vielen nicht kultivierbaren Arten im Darm eine Herausforderung. Große Veränderungen bei Bakterien mit unterschiedlichen Funktionen in der Stoffwechselökologie des Darms können jedoch die Darmbiochemie genau vorhersagen8,11,32. In dieser Studie haben wir unseren metatranskriptomischen Datensatz nach biochemischen Reaktionen durchsucht, die auf Elektronenakzeptoren und dem Redoxpotential basieren. Wir beobachteten nach der Antibiotikabehandlung eine signifikant erhöhte Transkription von Signalwegen, an denen Sauerstoff und Nitrat als terminale Elektronenakzeptoren beteiligt sind (Abb. 4a), in der Glukose-Diät im Vergleich zur Ballaststoff-Diät. Wir beobachteten auch eine erhöhte Atmung und ETC-Aktivität, was auf einen stärkeren oxidativen Stoffwechsel hinweist (Abb. 4f, g) (Ergänzende Abb. 6a, Ergänzende Daten 8). Dieser Anstieg des Redoxpotentials im Darm führt thermodynamisch zu einer erhöhten Atmungsaktivität und schränkt die biochemische Aktivität von Bakterien ein, die überwiegend auf dem fermentativen Stoffwechsel beruhen. Mehrere Studien haben ergeben, dass Darmflora, die mit einer verbesserten Gesundheit einhergeht, Fermentation nutzt, um kurzkettige Fettsäuren zu erzeugen und ein anaerobes Milieu im Darm aufrechtzuerhalten33,34. Wir fanden heraus, dass eine Ballaststoffergänzung mit einer erhöhten Expression kohlenhydrataktiver Enzyme34 (CAZymes) verbunden war, die am Polysaccharidabbau beteiligt sind. Der Ballaststoffcocktail war mit einer erhöhten Expression von Gesamt-CAZymen sowie faserspezifischen CAZymen verbunden, die am Abbau von Pektin und Inulin beteiligt sind (ergänzende Abbildung 5a, b). Dies weist darauf hin, dass das Mikrobiom von mit Ballaststoffen versorgten Mäusen eine erhöhte Expression von Enzymen aufweist, die Substrate für die Fermentation liefern könnten.

(a) Signifikante Unterschiede in der HUMaN3-Reaktionsexpression während D5 des Experiments über den Redoxturm, bestimmt durch MaAsLin2. Der auf der x-Achse angezeigte Koeffizient und die Punktgröße stellen q-val = FDR dar. Vollständige Ergebnisse in den Zusatzinformationen. (b) Wärmekarte, die die Häufigkeit von MAGs mit den Komplexen 1 D1 und D5 (c) während des Experiments zeigt. Weiße Kästchen stellen Werte außerhalb der Skala dar. Änderung der Häufigkeit von MAGs des Komplexes 1, dargestellt mit zweiseitigem Mann-Whitney für die Signifikanz D1, Glukose-p-Wert = 0,0043, Faser-p-Wert = 0,0087 (d) und D5, Glukose-p-Wert = 0,0022, Faser-p-Wert = 0,0260 (e) des Experiments (n = 6) *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. (f) Änderungen in der Expression von Superoxiddismutase, adj p-Werte von links nach rechts = 0,0009, 0,0023, 0,0374, 0,0005. Veränderungen in der Expression von NAD(P)H-Dehydrogenase (Chinon), adj p-Werte von links nach rechts = 0,0033, 0,0119, 0,0268, 0,0006. (g) Veränderungen in der Expression von Nitratreduktase (Cytochrom), adj p-Werte von links nach rechts = 0,0478, <0,0001, 0,0478, 0,0240, 0,0449, 0,0081, 0,0161. Für f, g: (n = 6) Copm = Kopien pro Million Lesevorgänge. Mittelwert ± SEM Kruskal Wallis mit Dunn-Korrektur *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. (h) eH- und pH-Werte aus zusätzlichem Mausexperiment (n = 6). Mittelwert ± SEM-Signifikanz, bestimmt durch zweiseitigen Mann-Whitney-Test, p-Werte von links nach rechts = 0,0080, 0,0078, 0,0080. (i) Pourbaix-Diagramm, das die eH- und pH-Werte des lyophilisierten Blinddarminhalts von Mäusen mit und ohne Antibiotika zeigt, gemessen innerhalb von 24 Stunden nach der Rehydrierung mit RO-Wasser. (j) Abschlussschema.

Die lineare Diskriminanzanalyse identifizierte ähnliche Stoffwechselsignaturen auf Signalwegebene. Ballaststoffe sind mit erhöhten Kohlenstofffixierungswegen verbunden, die als Calvin-Benson-Bassham-Zyklus klassifiziert werden (ergänzende Abbildung 7b, ergänzende Daten 7) und mit Pfaden, die an einer erhöhten Produktion von Coenzym A beteiligt sind (ergänzende Abbildungen 7b, d), was ein weiterer Indikator dafür sein könnte erhöhte Kohlenstofffixierung. Darüber hinaus wurden Stoffwechselwege, die nur in einer anaeroben Umgebung vorkommen, signifikant mit der Ballaststoffgruppe in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass diese Diät den Sauerstoff im Darm reduziert und vor dem Stoffwechsel der Atemwege schützt. Dieser Anstieg der Kohlenstofffixierung könnte auf einen Anstieg von CO2 gegenüber O2 zurückzuführen sein, wie aus einer aktuellen Studie hervorgeht, die die in Bakterien gefundenen umgekehrten TCA-Zykluswege untersucht35,36. Diese Daten stehen im Gegensatz zu den aeroben oxidativen Wegen, die durch die Glukose-Diät induziert werden. Katabole oxidative Wege wie Glykolyse, TCA und der Pentosephosphatweg (ergänzende Abbildung 7a, c) waren am fünften Tag des Experiments mit der Glukose-Diät verbunden. Kurz gesagt ist die Glukose-Diät eher mit dem katabolen oxidativen Stoffwechsel verbunden, während die Ballaststoff-Diät mit dem anabolen reduktiven Stoffwechsel verbunden war. Dies deutet darauf hin, dass eine Ballaststoffergänzung den schützenden Fermentationsstoffwechsel fördern kann, indem sie das Redoxpotenzial und den Sauerstoffgehalt im Darm reduziert und zu einem Schutz vor dem schädlichen Atemwegsstoffwechsel führt, der nach einer Antibiotikabehandlung auftritt.

Die transkriptomischen Daten legen nahe, dass die ETC-Aktivität, insbesondere Komplex 1, an der in unseren Daten beobachteten Stoffwechselverschiebung beteiligt ist. Jüngste phylogenomische Studien haben ergeben, dass etwa 50 % der Bakterien über den Komplex 137,38 verfügen, und diese kommen hauptsächlich im Stamm der Proteobakterien vor. Das Vorhandensein von Komplex 1 kann ein Hinweis auf ihre bioenergetische Kapazität sein. Komplex 1 enthält große Eisen-Schwefel-Cluster, wodurch dieses Protein für hochenergetische Elektronentransfers verantwortlich ist. Basierend auf dem beobachteten signifikanten Anstieg der Gene für Untereinheiten von Komplex 1 (Abb. 3f, g) (ergänzende Abb. 6a) und der größeren Verschiebung des Redoxpotentials (Abb. 4a) stellten wir die Hypothese auf, dass Glukose möglicherweise die Zusammensetzung der Gemeinschaft bestimmt für eine erhöhte Häufigkeit von Komplex-1-Bakterien. Um zu verstehen, wie die in den jeweiligen Diäten beobachtete Stoffwechselverschiebung zur Zusammensetzung der Gemeinschaft beitrug, haben wir Phylophlan3.0 verwendet, um unsere 54 MAGs auf das Vorhandensein von Komplex 1 zu durchsuchen. Wir haben in unserem Datensatz 6 MAGs gefunden, bei denen wir festgestellt haben, dass sie Komplex 1 enthalten, und die wir beobachtet haben erhebliche Veränderungen in ihrer relativen Häufigkeit. Verglichen mit der Häufigkeit von Komplex 1 in allen Bakteriengenomen erklärt wahrscheinlich die anaerobe Umgebung des Darms die geringere Häufigkeit in unseren Proben (6/54). Wir fanden heraus, dass beide Diäten einen Tag nach der Antibiotikabehandlung zu einem Anstieg der Komplex-1-Bakterien führten (Abb. 4b, d), insbesondere der Untereinheit I (ergänzende Abb. 6). Allerdings wies die Glukose-Diät am fünften Tag des Experiments im Vergleich zur Kontrolle weiterhin eine größere Häufigkeit von Komplex-1-Bakterien auf, während die Ballaststoff-Diät einen Rückgang aufwies (Abb. 4c, e) (ergänzende Abb. 6). Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Anstieg auf 4 der 6 MAGs beschränkt war, bei denen festgestellt wurde, dass sie Komplex 1 enthalten. MAGs, die den Muribaculaceae und Bacteroidales zugeordnet wurden, zeigten keinen durch Antibiotika verursachten Anstieg der Häufigkeit. Obwohl das Vorhandensein von Komplex 1 das Überleben in einer Umgebung mit hohem Redoxgehalt verbessern kann, können viele andere Faktoren eine Rolle für die Fitness eines Bakteriums spielen, wie z. B. Antibiotikaresistenzgene, Wachstumsrate und Konkurrenz um Kohlenstoffquellen. Die Umgebung des Darms erzeugt auch chemische Gradienten und verfügt über eine spezifische räumliche Organisation der Bakterien, die die Zusammensetzung bestimmen11,12. Aufgrund dieser Heterogenität hat die Redoxumgebung möglicherweise nicht die gleiche Wirkung auf alle im Darm vorkommenden Bakterien. Hier stellen wir fest, dass eine Glukose-Supplementierung den Redox-Anteil im Darm erhöhen kann, was dazu führt, dass die Zusammensetzung des Mikrobioms im Vergleich zu einer mit Ballaststoffen ergänzten Ernährung komplexere 1-Bakterien enthält. Diese Bakterien tragen maßgeblich zur Stoffwechselverlagerung hin zum aeroben Atemwegsstoffwechsel bei, die bei der Glukoseergänzung während der Antibiotikabehandlung beobachtet wird (Abb. 4f, g) (Ergänzende Abb. 8a – d).

Bisher haben wir uns auf Sequenzierungsmethoden verlassen, um die Redoxumgebung im Darm bei Glukose- und Ballaststoffdiäten zu verstehen. Um zu beurteilen, ob sich die beobachteten Veränderungen in unseren metagenomischen und metatranskriptomischen Daten auf physiologische Veränderungen im Darm auswirken, haben wir veröffentlichte Methoden verwendet, um das chemische Redoxpotential im Blinddarminhalt unserer Mäuse zu messen4,32,39,40,41. Wir validierten diese Methoden zunächst an Mäusen, denen eine Standard-Chow-Diät verabreicht wurde, und stellten fest, dass Antibiotika das chemische Redoxpotential erhöhten (ergänzende Abbildung 9a – f). Diese Ergebnisse stimmen mit anderen Studien überein, die die Wirkung von Antibiotika auf das Redoxpotential messen4. Anschließend haben wir das chemische Redoxpotential des Blinddarminhalts von Mäusen gemessen, denen wir 5 Tage nach der Antibiotikabehandlung unsere Glukose- und Ballaststoffdiät verabreicht hatten. Wir wählten diesen Zeitpunkt auf der Grundlage der Sequenzierungsdaten, die auf große Veränderungen in der Nutzung von Komplex 1 bis zum 5. Tag des Experiments schließen ließen. Wir fanden heraus, dass nur die Glukose-Diät nach der Antibiotikabehandlung mit einem signifikanten Anstieg des Redoxpotentials im Darm verbunden war (Abb. 4h) (Ergänzende Abb. 9g – i). Da das Redoxpotential (eH) auch vom pH-Wert der Umgebung beeinflusst wird32, haben wir diese parallel gemessen und die Daten in einem Pourbaix-Diagramm abgebildet (Abb. 4i). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Ernährung die chemische Umgebung des Darms drastisch verändert und zu Veränderungen in der biochemischen Aktivität von Darmmikroben führt. ATP-Messungen aus diesen Proben zeigten nicht signifikante Veränderungen zwischen Kontroll- und Antibiotika-behandelten Gruppen (ergänzende Abbildung 9j, k). Antibiotikainduzierte Veränderungen in der chemischen Umgebung des Darms waren bei der Glukose-Diät signifikanter als bei der Ballaststoff-Diät, was auf die schützende Fähigkeit von Ballaststoffen zur Pufferung von Darmredox hindeutet.

Der stoffwechselgesteuerte Mechanismus der Anfälligkeit legt nahe, dass ein aktiver kataboler Stoffwechsel in Bakterien ihre Anfälligkeit gegenüber Antibiotika beeinflussen kann21. Die meisten mikrobiellen Studien haben dieses Phänomen bisher in vitro dokumentiert. In dieser Studie untersuchen wir den Zusammenhang zwischen Stoffwechsel und Antibiotika-Empfindlichkeit in der komplexen Population des Darmmikrobioms. Wir zeigen, wie Nahrungseinträge in das Darmmikrobiom die biochemische Produktion von Mikroben verändern können, was mit weitreichenden Veränderungen in der chemischen Umgebung des Darms einhergeht. Insbesondere beobachten wir, dass eine Veränderung des bakteriellen Stoffwechsels durch Nahrungsergänzung mit Ballaststoffen vor negativen antibiotischen Wirkungen schützen kann (Abb. 4j).

Unsere Arbeit zeigt große ernährungsbedingte metagenomische, metatranskriptomische und chemische Veränderungen in der Struktur und Funktion des Mikrobioms während der Antibiotikabehandlung. Die in dieser Studie verwendeten Multi-Omic-Methoden sind auf diesem Gebiet gut etabliert, chemische Messungen des Mikrobioms befinden sich jedoch noch in einem frühen Stadium. Obwohl es nur begrenzte Studien zur Messung des Redoxpotentials und des pH-Werts im Darm gibt, müssen diese Methoden noch weiter verbessert werden. Idealerweise sollte das Redoxpotential im Laufe der Zeit in der Darmumgebung gemessen werden. Dies ist nur mit drahtlosen In-vivo-Sensoren möglich, wie in Baltsavias et al.32 gezeigt. Weitere Studien zur Aufklärung der Dynamik der Veränderungen des Redoxpotenzials als Reaktion auf eine Ernährungsumstellung sind erforderlich, um die detaillierten Mechanismen des Antibiotikaschutzes zu verstehen. Bei jeder Ernährungsumstellung ist die Entfernung einer Komponente wie Ballaststoffe die Zugabe eines Ersatzes erforderlich, um eine gleichwertige Nährstoffzusammensetzung aufrechtzuerhalten. Es ist schwierig, einen idealen Ersatz zu finden, da die meisten tiersicheren Futterzusätze vom Wirt oder dem Mikrobiom verstoffwechselt werden können. In dieser Veröffentlichung haben wir Glukose als ballaststoffarme Ergänzung gewählt. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass es sich hierbei nicht um eine echte Kontrolle handelt, sondern eher um eine kontrastierende ballaststofffreie Ernährungsbedingung25,26.

Darüber hinaus konzentrieren wir uns in dieser Studie auf die Aktivität von Darmmikroben und klären nicht die Rolle des Wirtsbeitrags zur chemischen Umgebung des Gastrointestinaltrakts. Es wurde bereits beschrieben, dass eine ballaststoffarme und zuckerreiche Ernährung schädlich für den Wirt ist und zu einem erhöhten Sauerstoffgehalt im Magen-Darm-Trakt sowie zu Veränderungen der Immunantwort führt. Es hat sich gezeigt, dass dies die Wirksamkeit des Impfstoffs42 beim Menschen verringert, was darauf hindeutet, dass die Ernährung wichtige immunologische Auswirkungen hat. Diese Studien legen nahe, dass Glukose allein enorme physiologische Auswirkungen auf den Wirt hat, die sich auf die Magen-Darm-Umgebung auswirken können. In dieser Studie ermitteln wir nicht, ob Veränderungen in der Darmumgebung direkt durch die Nahrungskomponente, die Verarbeitung der Nahrung durch den Wirt oder durch die Aktivität der Mikrobiota in der Nahrung hervorgerufen werden.

Wir sehen jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Gewebemorphologie oder der Zytokinproduktion (ergänzende Abbildung 10) zwischen den Gruppen, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass die Dauer des Experiments auf 5 Tage begrenzt ist. Obwohl es keine signifikanten Unterschiede in der Morphologie oder der Zytokinproduktion gibt, gibt es aufgrund der Glukose-Supplementierung wahrscheinlich metabolische Konsequenzen für die Wirtszellen, die indirekt die Funktion des Mikrobioms beeinflussen können. Wir haben zusätzliche differenzielle Expressionsanalysen unserer „Omic“-Daten einbezogen, um Mikrobiomeffekte zu vergleichen, die allein durch die Ernährung ohne Antibiotika hervorgerufen werden, und haben diese Daten einer interaktiven Rshiny-App hinzugefügt (https://belenkylab.shinyapps.io/shiny). Dies ermöglicht eine bessere Interpretation der grundlegenden Mikrobiomveränderungen durch die jeweiligen Diäten.

Diese Arbeit macht wichtige Fortschritte bei der Verknüpfung von Veränderungen des ernährungsbedingten Redoxpotentials und der daraus resultierenden mikrobiellen Aktivität mit der unterschiedlichen Antibiotika-Empfindlichkeit. Die nächsten wichtigen Schritte bestehen darin, den Kausalzusammenhang zwischen Änderungen des Redoxpotentials und der Antibiotika-Empfindlichkeit im Kontext des Wirts festzustellen. Zukünftige Studien können sich auf die Untersuchung der direkten Auswirkungen der Ernährung auf den Stoffwechsel der Wirtszellen im Zusammenhang mit Mikrobiomveränderungen konzentrieren und feststellen, ob sich die beobachteten Unterschiede auf männliche Mäuse übertragen lassen. Der Stoffwechsel ist grundsätzlich ein Balanceakt zwischen Wachstum und den toxischen Folgen dieser Aktivität. Wir hoffen, dass zukünftige Anti-AID-Therapien auf dieses Stoffwechselgleichgewicht abzielen können, um optimale Therapieergebnisse ohne mikrobiombedingte Morbidität zu erzielen.

Experimentelle Verfahren mit Mäusen wurden alle vom Institutional Animal Care and Use Committee der Brown University unter der IACUC-Protokollnummer 1706000283 genehmigt. Vier Wochen alte weibliche C57BL/6J-Mäuse wurden von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) gekauft. Nach ihrer Ankunft an der Brown University wurden die Mäuse zwei Wochen lang daran gewöhnt. Alle Tiere wurden gemeinsam unter spezifisch pathogenfreien (SPF), temperaturkontrollierten (21 + 1,1 °C), 30–70 % Vol. Luftfeuchtigkeit und 12-stündigen Licht-/Dunkelwechselbedingungen gehalten. Nach der Gewöhnungsphase wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in neue Käfige eingeteilt. Den Mäusen wurde das angegebene Futter in Pulverform verabreicht. Mäuse, die in (ergänzende Abbildung 9a – f) für Redoxpotentialmessungen verwendet wurden, erhielten das typische Laborfutter (Laboratory Rodent Diet 5001, LabDiet, St. Louis, MO, USA).

Gereinigte Diäten wurden mit Tierärzten von Envigo-Teklad (Madison, WI, USA) auf der Grundlage des Ballaststoffgehalts im typischen Laborfutter von Mäusen entwickelt. Die Diät basiert auf der weit verbreiteten Diät mit gereinigtem AIN-93G (TD.180901) und wurde so modifiziert, dass sie reduzierte Kohlenhydrate enthält, wobei die Zellulose vollständig entfernt und die Maisstärke reduziert wird. Darüber hinaus wird die in der Nahrung enthaltene Maisstärke (Buffalo-Maisstärke, Envigo-Teklad) so modifiziert, dass sie für den Wirt besser zugänglich ist, wodurch ihre Prävalenz im Blinddarm und im unteren Gastrointestinaltrakt verringert wird. Diese Diät wurde speziell mit einer Zusammensetzung von 80 % entwickelt, um eine 20 %ige (Gew./Gew.) Ergänzung mit anderen Kohlenstoffquellen zu ermöglichen, ohne die Protein-, Fett-, Vitamin- und Mineralstoffverhältnisse zu beeinträchtigen. Das Futter wird pulverisiert und bestrahlt und den Mäusen in Futtergläsern verabreicht. Den Mäusen wurden 5 g/Maus pro Tag in den Gläsern zugeteilt und das Futter wurde täglich in neuen autoklavierten Futtergläsern aufgefüllt. Diese Menge wurde nach Gesprächen mit Envigo-Teklad-Tierärzten ermittelt und liegt weit über der typischen Menge, die Mäuse verzehren. Die Glukose-Diät wurde in allen Experimenten ohne Ballaststoffe angewendet und mit 20 % Glukose (Fisher Scientific) ergänzt. Die Ballaststoffdiät enthält 20 % (w/w) Ergänzung eines maßgeschneiderten Ballaststoffcocktails, einschließlich Inulin (15 %) (Chem-Impex), Pektin (15 %) (MP Biomedicals), Dextrin (15 %) (Sigma-Aldrich), Levan (15 %) (Realbiotech CO., Ltd), Arabinoxylan (20 %) (Anthony's Organics), Beta-Glucan (25 %) (Anthony's Organics), Cellulose (10 %) (EMD Millipore). Für die Ergänzung mit einzelnen gereinigten Ballaststoffen in der ergänzenden Abbildung 1 wurde eine 95-prozentige Zusammensetzung derselben Nahrung mit einer 5-prozentigen (Gew./Gew.) Ergänzung an Pektin oder Inulin verwendet.

C57BL/6J-Mäusen wurde nach der Gewöhnungsphase eine Woche Zeit gegeben, sich an die ballaststofffreie Ernährung mit 20 % (Gew./Gew.) Glucose zu gewöhnen. Nach dieser Eingewöhnungsphase an die Ernährung wurden die Mäuse für jede Diät/Antibiotika-Bedingung randomisiert in neue Käfige eingeteilt. Amoxicillin wurde über das Trinkwasser (25 mg/kg/Tag) ad libitum zu den angegebenen Zeitpunkten verabreicht. Das gesamte Trinkwasser wurde vor der Verabreichung filtersterilisiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Stuhlproben gesammelt und bis zur Nukleinsäureextraktion bei –20 ° C gelagert. Der Blinddarminhalt wurde direkt in Bead-Bashing-Röhrchen mit DNA/RNA-Schutz (Zymo Research (Irvine, CA, USA) gesammelt und zur Nukleinsäureextraktion bei –80 ° C gelagert. Für die eH- und pH-Messungen wurde der gesamte Blinddarminhalt sofort schockgefroren in flüssigem Stickstoff und lyophilisiert und bis zur Messung bei –80 °C gelagert.

Die gesamten Nukleinsäuren (DNA und RNA) wurden aus Proben mit den ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kits von Zymo Research (Irvine, CA, USA) extrahiert, wobei die Extraktionsprotokolle gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurden. Für Stuhlproben wurde das Fecal 96 Zymo DNA Extraction Kit verwendet. Für die DNA/RNA-Parallelextraktion wurde das Zymo Magbead DNA/RNA-Kit verwendet. Die Gesamt-DNA wurde in nukleasefreiem Wasser eluiert und vor der Verwendung in Amplikon-/Bibliothekspräparationen mithilfe der dsDNA-HS auf einem QubitTM 3.0-Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert.

Die hypervariable 16S-rRNA-V4-Region wurde aus der Gesamt-DNA unter Verwendung des barcodierten 515F-Vorwärtsprimers und der 806R-Rückwärtsprimer des Earth Microbiome Project43 amplifiziert. Amplikons wurden mit 5X Phusion High-Fidelity DNA Polymerase unter den folgenden Zyklusbedingungen erzeugt: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, gefolgt von 25 Zyklen bei 98 °C für 10 s, 57 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, dann eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min. Zur Visualisierung der Amplifikate wurde Gelelektrophorese eingesetzt und in äquimolaren Mengen gepoolt. Die gepoolte Amplikonbibliothek wurde dem Rhode Island Genomics and Sequencing Center der University of Rhode Island (Kingston, Rhode Island, USA) zur Sequenzierung auf der Illumina MiSeq-Plattform übermittelt. Die Amplifikate wurden mit dem 600-Zyklen-Kit und Standardprotokollen am gepaarten Ende sequenziert (2 × 250 bp).

Rohe 16S-rRNA-Reads wurden zunächst mit idemp demultiplext. Qualitätsfilterung, Trimmen, Rauschunterdrückung mit DADA244 (q2-dada2) und Zusammenführung mit der Qiime2-Pipeline (Version 2019.10)45. Ribosomale Sequenzvarianten wurden mit mafft46 (q2-Alignment) abgeglichen, und die phylogenetische Baumkonstruktion erfolgte mit fasttree247 (q2-Phylogenie). Die taxonomische Zuordnung wurde mit dem vorab trainierten Naive Bayes-Klassifikator und dem q2feature-Classifier48 durchgeführt, der auf der SILVA 132 99 %-Datenbank trainiert wurde49. Alpha-Diversität (Shannon, Faiths phylogenetische Diversität) und Beta-Diversität (Bray-Curtis-Unähnlichkeit) wurden mit dem Phyloseq-Paket50 (Version 1.30.0) in R (Version 3.6.2)50,51 berechnet.

Metagenomische und metatranskriptomische Sequenzierungsbibliotheken wurden wie in Lit. beschrieben hergestellt. 2 Cabral 2020. Für metagenomische Bibliotheken wurden 100 ng DNA mit dem NEBNext® Ultra II FS DNA Library Prep Kit (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um einen Pool von Fragmenten mit 300 bp ± 50 zu erzeugen bp. Metatranskriptomische Bibliotheken wurden mit Gesamt-RNA (1 μg) unter Verwendung des MICROBExpress-Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), des NEBNext® rRNA Depletion Kit für Mensch/Maus/Ratte (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) und des erstellt NEBNext® Ultra II Direction RNA Sequencing Prep Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um einen Pool von Fragmenten mit 300 bp ± 50 bp zu erzeugen. Metagenomische und metatranskriptomische Bibliotheken wurden auf dem Illumina HiSeq X Ten paarend sequenziert (2 × 150 bp). Durchschnittlich 12.928.385 Lesevorgänge pro metagenomischer Probe und 52.848.755 Lesevorgänge pro metatranskriptomischer Probe. Eine metagenomische Kontrollsequenzierungsbibliothek wurde unter Verwendung des Zymobiomics Microbial Community Standard (D6300, Zymo Research) (Irvine, CA, USA) erstellt und dem Sequenzierungslauf hinzugefügt. Diese Daten wurden verwendet, um die Genauigkeit des Sequenzierungslaufs zu validieren. Die Sequenzierung dieses Standards führte zu relativen Häufigkeiten nahe der theoretischen Zusammensetzung, wobei alle Community-Mitglieder identifiziert wurden.

Metagenom-assemblierte Genome aus den metagenomischen Lesevorgängen wurden mithilfe der metaWRAP-Pipeline52 konstruiert. Rohlesevorgänge wurden mit dem READ_QC-Modul mit FASTQC 0.11.8 und TrmGalore 0.5.0 verarbeitet. Der Zusammenbau erfolgte mit dem ASSEMBLE-Modul in metaWRAP mit metaSPAdes 3.13.053 und MegaHit 1.1.354. Zusammengesetzte Contigs wurden mit dem BINNING-Modul unter Verwendung von CONCOCT 1.0.0, MaxBin2 2.2.655 und metaBAT2 2.12.156 gruppiert. Die Module BIN_REFINEMENT und BIN_REASSEMBLY wurden verwendet, um Behälter zu konsolidieren und Behälter mit mehr als 90 % Fertigstellung und weniger als 10 % Kontamination auszuwählen, um 54 hochwertige MAGs zu erhalten. Die Quantifizierung erfolgte mit dem Modul QUANT_BINS mit SALMON 0.13.157 und die Klassifizierung mit dem Modul CLASSIFY_BINS und taxator-tk 1.3.3e. Zur Verbesserung der Bin-Klassifizierung wurde auch das Tool CAT and BAT 2021-01-0758,59,60 verwendet.

PhyloPhlAn 3.031 wurde verwendet, um einen phylogenetischen Baum aus den zusammengestellten MAGs unter Verwendung der Option „Hohe Diversität“ und der PhyloPhlAn-Datenbank zu erstellen. Um MAGs mit Komplex 1 zu identifizieren, wurde eine benutzerdefinierte Phylophlan-Datenbank unter Verwendung der Uniref90-Sequenzcluster für jede der 14 Untereinheiten (A–N) der bakteriellen NADH-Chinon-Oxidoreduktase erstellt. Ergänzende Daten 2 enthalten die Cluster-ID und Größeninformationen. Anschließend wurde PhyloPhlAn unter Verwendung dieser Datenbank ausgeführt, um einen phylogenetischen Baum von MAGs zu erstellen und komplexe 1-MAGs zu identifizieren.

Rohe metagenomische und metatranskriptomische Lesevorgänge wurden mit KneadData (Version 0.6.1) wie zuvor beschrieben beschnitten und dekontaminiert 1,2,32. Illumina-Adaptersequenzen wurden mit Trimmomatic 56 (Version 0.36) entfernt und dann mit Bowtie2 (Version 2.2) 1,57. Bei metatranskriptomischen Lesevorgängen wurden zusätzlich Sequenzen abgereichert, die mit den ribosomalen RNA-Datenbanken SILVA 128 LSU und SSU Parc übereinstimmen, wie zuvor beschrieben 1,2.

Die Klassifizierung metagenomischer Lesevorgänge erfolgte mit NCBI RefSeq unter Verwendung von Kraken2 (Version 2.0.7-beta, „Kraken2 Standard Database“) mit einer k-mer-Länge von 35 (Wood et al.61). Bracken (Version 2.0.0) wurde dann verwendet, um die Häufigkeit auf Phylum- und Artenebene aus Kraken2-Berichten zu berechnen, und das R-Paket phyloseq (Version 1.28.0) wurde verwendet, um A- und B-Diversitätsmetriken zu berechnen62.

Eine modifizierte Version der SAMSA2-Pipeline (Simple Annotation of Metatranscriptomes by Sequences Analysis 2) zum Kommentieren getrimmter und dekontaminierter Lesevorgänge wie zuvor beschrieben1,63,64. Diese modifizierte Pipeline verwendet das Dienstprogramm Paired-End Read Merger (PEAR) zum Zusammenführen von Lesevorgängen und den DIAMOND-Aligner-Algorithmus (Version 0.9.12)62,65 zur Ausrichtung an den RefSeq-, SEED-Subsystem- und CAZyme-Datenbanken34,66.

HUMAnN328 wurde verwendet, um Veränderungen in der Genexpression anhand bereinigter metatranskriptomischer und metagenomischer Lesevorgänge zu identifizieren. Die Lesevorgänge wurden mit den Datenbanken UniProt/UniRef 2019_01 abgeglichen, um die Expression von Reaktionen zu identifizieren, und MetaCyc, um die Expression von Signalwegen zu identifizieren. MetaPhlAn 3.028 und die ChocoPhlan-Pangenomdatenbank wurden verwendet, um Reads den Bakterienarten zuzuordnen. Lesevorgänge, die auf Reaktionen und Signalwege ausgerichtet sind, werden auf die Sequenzierungsabdeckung normalisiert und in den metatranskriptomischen und metagenomischen Proben als Kopien pro Million (cpm, Copm) angegeben.

Das Redoxpotential wurde gemäß einem modifizierten Protokoll67 von32,40,41 mit einer Ag/AgCl-Referenzelektrode (Radiometer Analytical E21M002, Radiometer Analytical Pt-Plattenelektrode 5 × 5 mm M241 Pt) und einem Voltmeter gemessen. Schockgefrorener und lyophilisierter Blinddarminhalt wurde zunächst im Verhältnis 1:10 in RO-Wasser rehydriert und 10 Minuten lang mit 10-minütigen Pausen über 60 Minuten verwirbelt. Die Proben wurden verblindet und in zufälliger Reihenfolge gemessen. Diese Extrakte wurden dann zur Messung von eH und pH innerhalb von 24 Stunden (Abb. 4) oder 96 Stunden (Ergänzende Abb. 9g – i) verwendet. Jede Probe wurde vor der Messung eine weitere Minute lang geschüttelt. Als Basis für die Proben wurde eine 0,1 M KCL-Agarplatte verwendet. Eine geschnittene Plastikpipettenspitze wurde in den Agar eingeführt, um 300 μl des Blinddarmextrakts aufzunehmen. Die Platinelektrode wurde in die Probe eingeführt und die Referenzelektrode wurde in den 0,1 M KCL-Agar eingeführt. Das Redoxpotential konnte sich 20 Minuten lang (Abb. 4) oder 15 Minuten lang (ergänzende Abbildung 9g – i) stabilisieren, bevor die Spannung aufgezeichnet wurde. Die Elektroden wurden zwischen den einzelnen Messungen gereinigt und 1 Minute lang in die RENOVO-Reinigungslösung (Hach, Loveland, CO, USA) gelegt. Anschließend wurde die Elektrode mit RO-Wasser gespült und zur Messung einer 220-mV-Redoxpufferlösung verwendet, um die Integrität der Elektrode vor der Messung der nächsten Probe zu überprüfen. Dieselben Blinddarmextrakte wurden zur Messung des pH-Werts mit einem pH-Meter und zur anschließenden Validierung mit ATP-Assays, 16S-rRNA-Sequenzierung und qPCR-Bakterienlast verwendet.

Blinddarmextrakte aus den eH- und pH-Messungen wurden verwendet, um ATP mit dem BacTiterGlo Microbial Cell Viability Assay (Promega, Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu messen. In jedem Test wurde außerdem eine Standardkurve gemessen, um die Testmethoden zu validieren.

Die quantitative PCR zur Bestimmung der Bakterienlast wurde wie zuvor in Vasihnava et al. beschrieben durchgeführt. Q-PCR-Analyse bakterieller genomischer DNA mit iTaq Master Mix (BioRad, Hercules, CA, USA) und universellen 16S-rRNA-Genprimern. Ein Standard wurde unter Bezugnahme auf klonierte bakterielle DNA konstruiert, die einem 179 bp langen Abschnitt des 16S-rRNA-Gens entspricht, der unter Verwendung von 16s-RNA-spezifischen Primern amplifiziert wurde. Die Sq-Werte wurden auf die DNA-Menge in der Probe normalisiert.

Nach der Tötung des Tieres wurde durch Herzpunktion Vollblut gewonnen und zur 30-minütigen Koagulation in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Die Sammelröhrchen wurden dann 10 Minuten lang bei 13.000 × g zentrifugiert, um das Serum abzutrennen, das dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bis zur weiteren Verarbeitung bei –80 °C eingefroren wurde. Wenn die Proben fertig waren, wurden sie auf Eis aufgetaut und in einen Arbeitsaliquot und einen wieder eingefrorenen Stammaliquot aufgeteilt. Das Arbeitsaliquot wurde unter Verwendung des Durchflusszytometrie-Kits LEGENDplex Mouse Inflammation Panel (13-plex) (BioLegend, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Anzeichen einer Entzündung bei Mäusen analysiert. Die Proben wurden auf dem Attune NxT-Durchflusszytometer (ThermoFisher, Waltham, MA) analysiert und anschließend mit dem LegendPlex Cloud-Softwaretool (BioLegend, San Diego, CA) ausgewertet.

Spezifische Details der statistischen Analysen für alle Experimente sind in den Legenden zu den Abbildungen und im Abschnitt „Ergebnisse“ aufgeführt. Alle Probennummern stellen biologische Replikate dar. PERMANOVA wurde unter Verwendung der Adonis-Methode auf Bray-Curtis-Distanzmatrizen berechnet, die aus der mehrdimensionalen Skalierung von Sequenzierungsdaten unter Verwendung von Phyloseq berechnet wurden. Kontrollproben wurden mit in jeder Gruppe mit Antibiotika behandelten Proben verglichen, um die Stärke der antibiotischen Wirkung zu bestimmen. LEfSe (Version 1.0) wurde verwendet, um HUMAnN3-Ausgaben auf dem Galaxy-Webserver mit Standardeinstellungen zu analysieren (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy). Von SAMSA2 generierte metatranskriptomische Ausgaben wurden einem Differentialhäufigkeitstest mit dem DESeq2-Paket (1.24.0) in R (Version 3.5.2) unter Standardparametern unterzogen und umfassten Kontrast:Interaktionsvergleiche68. Alle DESeq2-Ergebnisse wurden mit der Benjamini-Hochberg-Methode (FDR = p-adj) korrigiert, um das Testen mehrerer Hypothesen zu berücksichtigen. ANOVA, ungepaarte t-Tests und Mann-Whitney U-, Kruskal-Wallis-Tests wurden in Prism GraphPad (Version 9.0) ohne Schätzung der Stichprobengröße durchgeführt. MaAsLin2 wurde verwendet, um signifikante Signalweg- und Reaktionsanmerkungen aus HUMAnN3-Ausgaben zu identifizieren. FDR = −log(qval).

Die in dieser Studie generierten kurzgelesenen metagenomischen und metatranskriptomischen Sequenzierungsdaten wurden in der NCBI SRA-Datenbank hinterlegt. Die Metagenom-assemblierten Genome (MAGs) wurden bei der NCBI GenBank hinterlegt. Die 16s-Sequenzierungsdaten wurden bei NCBI SRA hinterlegt. Der BioProject-Zugangscode für alle mit dieser Studie verbundenen Sequenzen lautet PRJNA984334. Die in dieser Studie generierten DESeq2-, LDA- und MaAsLin2-Ergebnisse sind in den Zusatzinformationen enthalten. Quelldaten enthalten alle PERMANOVA-Statistikinformationen. In dieser Studie verwendete Datenbanken (MMTV, Zugang NC_001503), (MOV, Zugang NC_001506.1), ribosomale RNA-Datenbanken SILVA 128 LSU und SSU Parc (https://www.arb-silva.de/documentation/release-128), RefSeq (https://doi.org/10.1093/nar/gkt1274.), SEED-Subsystem (https://doi.org/10.1093/nar/gkt1226), CAZyme-Datenbanken (https://doi.org/10.1093/nar /gkn663), UniProt/UniRef 2019_01 Datenbanken (https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btm098), SILVA 132 99% Datenbank (https://www.arb-silva.de/download/archive/qiime). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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SP und BJK wurden vom Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unter der Fördernummer 1644760 unterstützt. PB wurde vom National Center for Complementary and Integrative Health mit der Fördernummer (R21 AT010366) und vom National Institute of Diabetes and Digestive and unterstützt Nierenerkrankungen (R01 DK125382). Die Förderagenturen waren an der Gestaltung und Erstellung dieses Manuskripts nicht beteiligt. Wir möchten uns auch bei Realbiotech CO., Ltd (Choong-gu, Seoul, Republik Korea) für die großzügige Spende gereinigter Levan-Fasern bedanken. Diese Studie nutzte den vom DHHS/NCI Cancer Center (P30CA16672) unterstützten Forschungskern für Histologie, Pathologie und Bildgebung sowie Rechenressourcen des Center for Computation and Visualization der Brown University. Die Finanzierungsagenturen spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung, der Analyse oder der Interpretation. Die hier dargestellten Meinungen und Interpretationen sind nicht repräsentativ für die Stellung der Fördergeber.

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und Immunologie, Brown University, Providence, RI, 02912, USA

Swathi Penumutchu, Benjamin J. Korry und Peter Belenky

Abteilung für Pathologie und Labormedizin, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Katharine Hewlett

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Konzeptualisierung und Methodik: SP und PB Formale Analyse: SP, KH, Untersuchung: SP, BJK, Datenkuration: SP; Schreiben – Originalentwurf: SP und PB; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: SP und PB; Statistische Validierung: SP; Visualisierung: SP; Betreuung: PB; Fördermitteleinwerbung: PB

Korrespondenz mit Peter Belenky.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Penumutchu, S., Korry, BJ, Hewlett, K. et al. Eine Ballaststoffergänzung schützt vor einer Antibiotika-induzierten Dysbiose des Darmmikrobioms, indem sie das Redoxpotential des Darms moduliert. Nat Commun 14, 5161 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40553-x

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Eingegangen: 11. Mai 2023

Angenommen: 31. Juli 2023

Veröffentlicht: 24. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40553-x

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